乳糖酶是一種生物酶製劑，主要用來治療乳糖不耐受症。研究人員利用基因工程技術，將人工優化的米麴黴乳糖酶基因（la...

問題詳情：

乳糖酶是一種生物酶製劑，主要用來治療乳糖不耐受症。研究人員利用基因工程技術，將人工優化的米麴黴乳糖酶基因（lacA）匯入乳*克魯維酵母細胞，獲得了高效表達乳糖酶的重組菌株。下圖1為載體PKLACl的限制酶切圖譜（總長度為9091bp，bp表示鹼基對；XhoⅠ、BglⅡ、SacⅡ表示限制酶，數字代表鹼基的編號），amdS基因編碼的乙醯*酶能夠將乙醯*降解成氨，只有轉化成功的乳*克魯維酵母才能在乙醯*作為唯一氮源的培養基中生長。圖2為含有lacA的DNA片段。

請回答下列問題：

（1）米麴黴合成並分泌至胞外的乳糖酶能將乳糖分解為________。

（2）優化後的米麴黴乳糖酶基因片段lacA中G-C鹼基含量由原來的51.4%降低到39.2%，使乳*克魯維酵母偏愛的密碼子出現的頻率大幅度增加，從而在不改變乳糖酶________序列的前提下，提高了重組菌株該基因表達中________（填具體步驟）的效率。

（3）將優化的米麴黴乳糖酶基因片段lacA與pKLACl分別使用用XhoⅠ、BelⅡ雙酶切，然後用________連線,得到含目的基因的重組質粒（pKLAC1—lacA，長度為12040bp）。若目的基因置換了pKLACl中一段長33bp的片段，則目的基因的長度為________bp.

（4）用小劑量質粒提取試劑盒提取重組質粒，對所提取的重組質粒用SacⅡ單酶切後純化，純化產物用1%瓊脂凝膠進行電泳檢測。若結果如圖3中的第________（填序號）泳道所示，則說明優化後的目的基因片段lacA成功構建在質粒pKLACl中。

（5）將重組質粒pKLACl-lacA用SacⅡ單酶切使其線*化，純化後與感受態乳*克魯維酵母細胞混合、轉化。用________適當稀釋細胞液，均勻地塗布於________平板上進行培養，富集並篩選重組菌株。將篩選出的重組菌株進行發酵培養120h，檢測________，最終獲得高效表達乳糖酶的重組菌株。

【回答】

葡萄糖和半乳糖氨基* 翻譯 DNA連線酶 2982 1、3 無菌水以乙醯*作為唯一氮源乳糖酶活*/活力

【解析】

基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因匯入受體細胞：根據受體細胞不同，匯入的方法也不一樣，將目的基因匯入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因*法和花粉管通道法；將目的基因匯入動物細胞最有效的方法是顯微注*法；將目的基因匯入微生物細胞的方法是感受態細胞法。（4）目的基因的檢測與鑑定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染*體的DNA是否*入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術，個體水平上的鑑定：抗蟲鑑定、抗病鑑定、活*鑑定等。

【詳解】

（1）乳糖由葡萄糖和半乳糖組成，故乳糖酶能將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。

（2）乳糖酶的化學本質是蛋白質，優化後的米麴黴乳糖酶基因片段lacA中G-C鹼基含量由原來的51.4%降低到39.2%，使乳*克魯維酵母偏愛的密碼子出現的頻率大幅度增加，從而在不改變乳糖酶氨基*序列的前提下，提高了重組菌株該基因表達中翻譯的效率。

（3）乳糖酶基因片段lacA與pKLACl分別使用XhoⅠ、BelⅡ限制*酶酶切，然後用DNA連線酶連線，得到含目的基因的重組質粒。題幹資訊可知，載體PKLACl的限制酶切圖譜總長度為9091bp，含目的基因的重組質粒（pKLAC1—lacA，長度為12040bp）。若目的基因置換了pKLACl中一段長33bp的片段，則目的基因的長度為12040909133=2982bp。