熒光蛋白(GFP)在紫外光下會發出綠*熒光,某科研團隊將GFP基因*入質體P中構建了重組質體載體P0,用於基因...
問題詳情:
熒光蛋白(GFP)在紫外光下會發出綠*熒光,某科研團隊將GFP基因*入質體P中構建了重組質體載體P0,用於基因工程中基因表達載體(P1)的篩選和鑑定。部分過程如下圖所示,下表為部分限制酶的識別序列及切割位點。回答問題:
(1)過程①中用EcoRV酶切獲得的目的基因具有_________末端,過程②表示利用PCR技術擴增目的基因,前提是要根據_________設計出引物,此外還需在引物的一端加上_________序列,以便於P1的構建和篩選。
(2)過程③中,質體P0需用限制酶_________切割,才能與擴增出的目的基因在_________酶作用下形成P1。
(3)為了篩選出含有質體P1的菌落,需採用添加_________的培養基平板進行培養,在紫外光激發下_________的菌落,即為含有P1的菌落。
(4)提取經上述篩選所得菌落的RNA,通過_________獲得DNA,再進行PCR擴增,若最終未能檢測出目的基因,可能的原因是__________。
【回答】
平 一段已知目的基因的核苷*序列 GATC BamHⅠ DNA連接 四環素 不發出綠*熒光 逆轉錄(反轉錄) 目的基因未能在受體菌中轉錄
【分析】
基因工程技術的基本步驟:
(1)目的基因的獲取:方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
(2)基因表達載體的構建:是基因工程的核心步驟,基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
(3)將目的基因導入受體細胞:根據受體細胞不同,導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因*法和花粉管通道法;將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注*法;將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。
(4)目的基因的檢測與鑑定:分子水平上的檢測:①檢測轉基因生物染*體的DNA是否*入目的基因--DNA分子雜交技術;②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術;③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑑定:抗蟲鑑定、抗病鑑定、活*鑑定等。
【詳解】
(1)從表格中看出用EcoRV酶切獲得的目的基因具有平末端;PCR擴增目的基因,需要根據一段已知目的基因的核苷*序列設計出引物;構建P1時,限制酶Sau3AⅠ會破壞四環素抗*基因(標記基因),所以只能選擇BamHⅠ,還需要在引物的一端加上GATC序列。
(2)根據(1)的分析,限制酶Sau3AⅠ會破壞四環素抗*基因(標記基因),而EcoRV酶破壞複製原點,所以需要用擇BamHⅠ酶進行切割,切割後的目的基因在連接酶的作用下形成P1。
(3)為了篩選含有質體P1的菌落,由於標記基因是四環素抗*基因,所以需採用添加了四環素的培養基平板進行培養在紫外光激發下,由於使用BamHⅠ酶破壞了GFP基因,所以選擇不發綠*熒光的菌落,即為含有P1的菌落。
(4)所得菌落的RNA通過逆轉錄(反轉錄)獲得DNA,再進行PCR擴增;若最終未能檢測出目的基因,可能的原因是目的基因未能在受體菌中轉錄。
【點睛】
本題考查基因工程的基本步驟,難點是根據質體的結構選擇合適的限制酶。識記運載體的特點即可解答。
知識點:基因工程
題型:綜合題
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